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外泌體鑒定western

更新時(shí)間:2024-09-26

簡要描述:

外泌體western鑒定用PBS重懸提取的外泌體,滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上,室溫靜置2 min,用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體,用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染5 min,濾紙吸干負(fù)染液,室溫晾干,電鏡觀察拍照。

  外泌體western鑒定時(shí)通常會(huì)檢測(cè)哪些指標(biāo)蛋白?
  根據(jù)22篇外泌體相關(guān)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì),排在前4位的檢測(cè)指標(biāo)為CD63(13/22)、Tsg101(8/22)、 CD9和CD81并列第三位(6/22);接著檢測(cè)較多的4個(gè)指標(biāo)為Alix(4/22)、 HSP70(3/22)、 flotillin (3/22)和Syntenin (2/22);此外還有一些指標(biāo)僅在1篇文獻(xiàn)中出現(xiàn)過,例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。
  針對(duì)外泌體的定性檢測(cè)至少選擇兩個(gè)指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表需要了,比如檢測(cè)CD63和Tsg101。
  外泌體western鑒定定性檢測(cè)中有沒有陽性對(duì)照?
  從發(fā)表的文章來看,并沒有一篇文章結(jié)果中提到了陽性對(duì)照樣品,但是已經(jīng)被文獻(xiàn)報(bào)道的樣品可以作為后人Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照,通過這樣陽性樣品的檢測(cè)來判斷實(shí)驗(yàn)體系是否正常。羅列一下文獻(xiàn)中的陽性對(duì)照樣品:脂肪組織巨噬細(xì)胞外泌體、神經(jīng)干細(xì)胞外泌體、大鼠皮層神經(jīng)元外泌體、SCC-9和Cal-27細(xì)胞外泌體、MDA-MB-231外泌體、星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體、中性白細(xì)胞外泌體等。
   外泌體western鑒定主要檢測(cè)指標(biāo)為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等,針對(duì)外泌體的定性檢測(cè),至少選擇2-3個(gè)指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表就可以。大部分文獻(xiàn)中沒有檢測(cè)內(nèi)參,個(gè)別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行檢測(cè),外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達(dá)豐度相對(duì)于正常細(xì)胞樣品中的較低,可能會(huì)檢測(cè)不到任何條帶或者條帶微弱。
  外泌體western鑒定操作步驟大致是:
  用PBS重懸提取的外泌體,滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上,室溫靜置2 min,用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體,用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染5 min,濾紙吸干負(fù)染液,室溫晾干,電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)(也會(huì)有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體),但電鏡對(duì)樣品的預(yù)處理和制備要求較高,樣品分離方法和樣品性質(zhì)可能影響電鏡結(jié)果的好壞;樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜,不適合對(duì)外泌體進(jìn)行大量快速的測(cè)量;且因外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程,無法準(zhǔn)確測(cè)量。
  掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束,以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上,利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像,獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展,場(chǎng)發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及,現(xiàn)代先進(jìn)的SEM的分辨率已經(jīng)達(dá)到1 nm左右,足夠用來進(jìn)行外泌體尺寸的測(cè)量。TEM是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上,電子與樣品中的原子碰撞而改變方向,從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān),因此可以形成明暗不同的影像,影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。
  以上兩種方法是常用的外泌體的鑒定方法,是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中,通過提取鑒定不同細(xì)胞系中的外泌體,進(jìn)而通過PCR以及測(cè)序篩選分析RNA,探究外泌體在腫瘤進(jìn)展或者耐藥中的發(fā)生機(jī)制。
 

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