外泌體western鑒定

更新時(shí)間：2024-09-26

簡要描述：

外泌體western鑒定主要檢測指標(biāo)為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，針對(duì)外泌體的定性檢測，至少選擇2-3個(gè)指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表就可以。大部分文獻(xiàn)中沒有檢測內(nèi)參，個(gè)別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行檢測，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達(dá)豐度相對(duì)于正常細(xì)胞樣品中的較低，可能會(huì)檢測不到任何條帶或者條帶微弱。

　　外泌體western鑒定主要檢測指標(biāo)為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，針對(duì)外泌體的定性檢測，至少選擇2-3個(gè)指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表就可以。大部分文獻(xiàn)中沒有檢測內(nèi)參，個(gè)別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行檢測，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達(dá)豐度相對(duì)于正常細(xì)胞樣品中的較低，可能會(huì)檢測不到任何條帶或者條帶微弱。

　　外泌體western鑒定操作步驟大致是：

　　用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染5 min，濾紙吸干負(fù)染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)(也會(huì)有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)，但電鏡對(duì)樣品的預(yù)處理和制備要求較高，樣品分離方法和樣品性質(zhì)可能影響電鏡結(jié)果的好壞；樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對(duì)外泌體進(jìn)行大量快速的測量；且因外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程，無法準(zhǔn)確測量。

　　掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及，現(xiàn)代先進(jìn)的SEM的分辨率已經(jīng)達(dá)到1 nm左右，足夠用來進(jìn)行外泌體尺寸的測量。TEM是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。

　　以上兩種方法是常用的外泌體的鑒定方法，是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，通過提取鑒定不同細(xì)胞系中的外泌體，進(jìn)而通過PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進(jìn)展或者耐藥中的發(fā)生機(jī)制。