但CE與質(zhì)譜接口的穩(wěn)定性不足、CE方法重復(fù)性略差、電泳分離過程受pH值和溫度等因素的影響，以及蛋白酶解物在電泳過程中的吸附造成樣本損失等問題的存在，限制了CE-MS在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的進一步應(yīng)用。

　　對細胞的精確認知是理解細胞在生理和病理過程中功能的先決條件。傳統(tǒng)研究手段是針對細胞群體進行分析，獲得大量細胞的平均化結(jié)果，無法區(qū)分不同細胞個體對于樣品異質(zhì)性的精確貢獻值，從而忽視或掩蓋了單細胞的個體差異。

　　單細胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多，豐度低，動態(tài)分布范圍寬且無法擴增，因此對檢測手段提出了更高的靈敏度要求。在眾多高靈敏分析方法中，熒光檢測方法的靈敏度可以達到單分子水平，并且具有動態(tài)跟蹤能力，但是其蛋白質(zhì)檢測通量有限。然而電化學(xué)檢測方法雖然細胞干擾小，但受限于蛋白質(zhì)通量以及電化學(xué)活性的要求，無法對多種蛋白質(zhì)進行同時檢測。

　　質(zhì)譜作為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一種常規(guī)方法，其靈敏度高，通過已有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以同時對上萬種蛋白質(zhì)進行定性以及定量，并且可以提供豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。但是由于單個體細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量平均只有約100pg，利用質(zhì)譜直接進行檢測會面臨樣本復(fù)雜度和單細胞靈敏度等挑戰(zhàn)，因此質(zhì)譜前的分離技術(shù)對于提高方法檢測靈敏度以及蛋白質(zhì)定性定量的準(zhǔn)確度來說十分必要。

　　細胞是構(gòu)成生物體的基本單位，由于遺傳因素、生化噪音、細胞微環(huán)境等諸多因素使得單個細胞之間存在著廣泛的異質(zhì)性。因此，單細胞研究不僅可使人類對細胞與生命的本質(zhì)有更為精確的認識，同時也為疾病的診斷、分型、治療以及預(yù)后提供了更為強有力的工具。蛋白質(zhì)作為生命活動的主要承擔(dān)者，可以為其提供更為直接且更有價值的表型信息，因此成為單細胞研究的熱點目標(biāo)。

　　單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多，豐度低，動態(tài)分布范圍寬且無法擴增，因此對檢測手段提出了更高的靈敏度要求。在眾多高靈敏分析方法中，熒光檢測方法的靈敏度可以達到單分子水平，并且具有動態(tài)跟蹤能力，但是其蛋白質(zhì)檢測通量有限。然而電化學(xué)檢測方法雖然細胞干擾小，但受限于蛋白質(zhì)通量以及電化學(xué)活性的要求，無法對多種蛋白質(zhì)進行同時檢測。質(zhì)譜作為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一種常規(guī)方法，其靈敏度高，通過已有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以同時對上萬種蛋白質(zhì)進行定性以及定量，并且可以提供豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。但是由于單個體細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量平均只有約100pg，利用質(zhì)譜直接進行檢測會面臨樣本復(fù)雜度和單細胞靈敏度等挑戰(zhàn)，因此質(zhì)譜前的分離技術(shù)對于提高方法檢測靈敏度以及蛋白質(zhì)定性定量的準(zhǔn)確度來說十分必要。

　　將蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析整合到單一的多組學(xué)方法中提供了在單個細胞中檢測RNA表達和蛋白質(zhì)豐度的動力學(xué)可能性，這反過來可能產(chǎn)生對復(fù)雜調(diào)控過程的機制性見解，例如表觀基因組、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因監(jiān)管。此外，同步的mRNA和蛋白質(zhì)分析可用于確定mRNA和蛋白質(zhì)水平在活躍的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控期間相關(guān)性較差的細胞狀態(tài)。

　　單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)工作流程

　　單細胞流程當(dāng)然也是從樣本處理開始。對樣本進行處理，使細胞分開和懸浮，然后通過熒光活化細胞分選（FACS）進行分離。單個細胞被分配到微量滴定板的各個孔中或芯片型分析系統(tǒng)上，在那里進行裂解。干擾質(zhì)譜分析的裂解劑需要除去，但由于純化會導(dǎo)致樣本損失，因此研究人員盡量避免使用。

　　FACS是細胞分選的shou選方法，但也存在缺點。損失率高（有時非常高），需要訓(xùn)練有素的操作人員，而且購買和操作成本都很高。

　　當(dāng)然，損失并不僅僅發(fā)生在細胞分選階段。“粘稠的蛋白質(zhì)很難通過液相色譜（LC）分離，因此這個步驟也會造成損失。這將會進一步造成靈敏度問題或分析偏倚。有時，您只是無法從單個細胞的蛋白質(zhì)中產(chǎn)生足夠的離子。”

　　為了解決這些靈敏度問題，一些操作方案將未標(biāo)記的載體蛋白添加到混合物中，以緩解小樣本量帶來的損失。雖然這些方法有點用，但仍需要質(zhì)譜技術(shù)的進步，特別是在電離效率方面的進步，才能處理小的樣本量和體積。

　　“如果沒有自動化液體處理系統(tǒng)，這些工作流程將無法實現(xiàn)，自動化系統(tǒng)帶來了準(zhǔn)確的納升級流體操作，以及一致性和穩(wěn)定性。”

　　早期對單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的嘗試使用了基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI），這是一種軟電離技術(shù)，可以保留不穩(wěn)定的分子特征，并最大限度減少樣本損失和樣本制備步驟。

　　基于MALDI的方法是在上世紀(jì)90年代使用的。人們采用MALDI作為離子源，并用飛行時間（TOF）作為質(zhì)量分析器，從而提供一種功能性的單細胞分析。不過，這些技術(shù)存在三個主要缺點：MALDI不能在時域內(nèi)分離肽段，無法對大量蛋白質(zhì)進行測序，而且MALDI電離的可變性會影響定量的準(zhǔn)確性。

　　另一種電離蛋白質(zhì)的方法，電噴霧電離（ESI），則更容易實現(xiàn)測序，因為它很容易與各種分離方法（如毛細管電泳）相結(jié)合。然而，ESI需要大量的樣本制備，這可能導(dǎo)致?lián)p失，讓人們無法接受。

　　直接的分析蛋白質(zhì)水平和RNA表達的方法是使用單個細胞的索引FAC同時測量同一細胞中的少量蛋白質(zhì)和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的水平。另一種方法依賴于鄰近延伸分析（PEA）與RNA分析并行進行蛋白檢測。

　　鄰近連接分析（PLA）依賴于兩個抗體結(jié)合的寡核苷酸在同一蛋白質(zhì)靶點上的連接而不是雜交。這種方法被用來研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的亞細胞定位，例如RNA的PLA在mass-cytometry工作流程中實現(xiàn)，以便能夠同時定量單個原代人類外周血單個核細胞中的10個轉(zhuǎn)錄物和相應(yīng)蛋白質(zhì)。

　　通過測序、RNA表達以及蛋白測序分析對轉(zhuǎn)錄組和表位進行細胞索引的兩種方法利用與DNA條形碼結(jié)合的抗體，以便能夠在單細胞水平上同時分析細胞表面蛋白質(zhì)和mRNAs。CyTOF與單細胞RNA測序相結(jié)合可以追蹤樹突狀細胞（DC）譜系的發(fā)育。

　　可以想象，將單細胞蛋白組學(xué)方法與多組學(xué)工具相結(jié)合，可以促進我們對細胞過程的理解，特別是對癌癥抵抗機制和治療反應(yīng)多樣性的理解。

　　實現(xiàn)單個細胞蛋白質(zhì)組成的定性定量分析，揭示細胞個體之間的精細差異

　　二代測序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展使對單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究突飛猛進，科學(xué)家們對細胞認識的分辨率大大提高，然而單細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對描述細胞在生物體復(fù)雜環(huán)境中的表型和功能還遠遠不夠，而蛋白質(zhì)作為細胞內(nèi)所有功能的直接執(zhí)行者，細胞通過蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾，可以感知并響應(yīng)幾乎所有外在和內(nèi)在的刺激，從而影響整個生命體的功能和狀態(tài)。

　　因此，對單細胞蛋白質(zhì)組的定性和定量分析，是揭示細胞類型及其狀態(tài)的工具，在腫瘤異質(zhì)性、干細胞分化、生殖細胞發(fā)育、循環(huán)腫瘤細胞等重要領(lǐng)域有著不可或缺的應(yīng)用價值。

　　單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的目的就是為了實現(xiàn)對單個細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的定性和定量分析，從而獲得不同細胞個體蛋白組的定性和定量差異，構(gòu)建精細蛋白分子圖譜，從根本上揭示不同細胞個體之間的類型及其狀態(tài)的差異，使科研工作者可以更好地了解細胞及其表型和生命活動。