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酶聯(lián)免疫吸附實驗 ELISA
更新時間:2019-05-09   點擊次數(shù):1526次

ELISA原理 --操作規(guī)則(新手適用)

酶聯(lián)免疫吸附實驗 ELISA

 

    ELISA法是免疫診斷中的一項新技術,現(xiàn)已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果,認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此,也適合于血清流行病學調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學各領域的應用范圍日益擴大,可概括四個方面: 1、免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

 一.實驗原理

     酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術,ELISA過程包括抗原抗體吸附在固相載體上稱為包被,加待測抗體抗原), 再加相應酶標記抗體抗原),生成抗原抗體)--待測抗體抗原)--酶標記抗體的復合物,再與該酶的底物反應生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體抗原的量。待測抗體抗原的定量與有色產(chǎn)物成正比。

    用于免疫酶技術的酶有很多,如過氧化物酶,堿性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰膽堿酯酶,6-磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶,堿性磷酸酯酶等,其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應,在呈色后須立刻測定,否則空氣中的氧化作用使顏色加深,無法準確地定量。

     辣根過氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白,每個分子含有一個氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm,所以酶的濃度和純度計算式是(已知HRPA(1cm 403nm 1%)25,式中1%指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶濃度以 mg/ml 計算是HRPA(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ(Reinheit Zahl)值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRPRZ值在3.0左右,高可達3.4。用于ELISA檢測的HRPRZ值要求在3.0以上。

 

   ELISA的基本原理有三條:

    1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學活性;
    2)抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性; 

  (3)酶結(jié)合物與相應抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在,而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。

 

二、實驗方法

    基本方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110μgml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。簡稱洗滌,下同。
  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔。
  3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體經(jīng)滴定后的稀釋度0.1ml。37℃孵育0.51小時,洗滌。
  4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,371030分鐘。
  5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
  6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm若以ABTS顯色,則410nm處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

   基本方法二 用于檢測未知抗體的間接法:
    用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110μgml, 每孔加0.1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。
    加一定稀釋的待檢樣品未知抗體0.1ml于上述已包被之反應孔中,37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照
    于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體抗抗體0.1ml37℃孵育30-60分鐘,洗滌,后一遍用DDW洗滌。
    其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6

     (二) 酶與底物

       酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關鍵試劑,它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應,還具有酶促反應,顯示出生物放大作用,但不同的酶選用不同的底物。

免疫技術常用的酶及其底物

底物

顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶

鄰苯二胺

橘紅色

492*

四甲替聯(lián)苯胺

黃色

460**

氨基水楊酸

棕色

449

鄰聯(lián)苯甲安

蘭色

425

2,2'-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

藍綠色

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

黃色

400

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽

紅色

500

葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

黃色

405,420

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭

深藍色

β-D-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

熒光

360,450

硝基酚半乳糖苷(ONPG)

黃色

420

 

     *  終止劑為2mol/L H2SO4

     ** 終止劑為2 mol/L檸檬酸, 不同的底物有不同的終止劑。

     可催化下列反應: HRP+H2O2→復合物 復合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無色底物, 供氫體; A—— 為有色產(chǎn)物。

 

  (三) ELISA常用的四種方法

 

   1直接法測定抗原

      將抗原吸附在載體表面;

      加酶標抗體,形成抗原—抗體復合物;

      加底物。底物的降解量=抗原量。

 

   2間接法測定抗體

     將抗原吸附于固相載體表面;

      加抗體, 形成抗原-抗體復合物;

      加酶標抗體;

      加底物。 測定底物的降解量=抗體量。

 

   3雙抗體夾心法測定抗原

     將抗原免疫種動物獲得的抗體吸附于固相表面;

     加抗原,形成抗原-抗體復合物;

     加抗原免疫第二種動物獲得的抗體,形成抗體抗原抗體復合物;

     加酶標抗抗體第二種動物抗體的抗體);

     加底物。底物的降解量=抗原量。

   4. 競爭法測定抗原

     將抗體吸附在固相載體表面;

     (1) 加入酶標抗原;

     (2),(3)加入酶標抗原和待測抗原;

     加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差=未知抗原量。

 

三.儀器和材料

    1. 聚苯乙烯微量細胞培養(yǎng)板-酶標板平板, 40孔, 96。

    2. 酶聯(lián)免疫檢測儀,50ul100ul加樣器。

    3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。

    4. 包被液:0.05mol/L PH9.6碳酸鹽緩沖液,4℃保存。 Na2CO3 0.159克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。

     5. 稀釋液:同洗滌緩沖液。 【或者牛血清白蛋白(BSA)0.1g加入洗滌緩沖液至100ml;或者加羊/兔血清與洗滌液配成5-10%

     6. 洗滌緩沖液:0.01mol/L PH7.4  PBS-Tween-20, 4℃保存。 NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20(0.05%)0.5ml。蒸餾水加至1000ml。

     7. 封閉液:0.5%雞卵清蛋白,pH7.4 PBS。

     8. 鄰苯二胺溶液底物:臨用前配制, 0.1M 檸檬酸(2.1g/100ml)6.1ml,  0.2M Na2HPO4·12H2O( 7 .163g/100ml)6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40ul。

     9. 終止液:2mol/L H2SO4。 蒸餾水178.3ml逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。

 

操作步驟

    1. 包被抗原:用包被液將抗原作適當稀釋, 一般為110微克/孔,每孔加200微升,37℃溫育1小時后,4℃冰箱放置1618小時。

    2. 洗滌:倒盡板孔中液體,加滿洗滌液,靜放三分鐘,反復三次,后將反應板倒置在吸水紙上,使孔中洗滌液流盡。

   3. 加封閉液200微升,37℃放置一小時。

   4. 洗滌同2。

   5. 加被檢血清:用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,,每孔200微升。同時作稀釋液對照。37℃放置2小時。

   6. 洗滌同2

   7. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37 1小時。

   8. 洗滌同2。

   9. 加底物:鄰苯二胺溶液加200ml,室溫暗處10--15分鐘。

   10. 加終止液:每孔50微升。

   11. 觀察結(jié)果:用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù)。

 

 

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