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免疫組化原理、流程及結(jié)果分析。
更新時間:2019-04-23   點(diǎn)擊次數(shù):5933次

免疫組化原理

     免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結(jié)合,然后用HRP等標(biāo)記的二抗與一抗進(jìn)行結(jié)合,后通過與DAB顯色劑反應(yīng),進(jìn)而確認(rèn)所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的

?     免疫化更多的意義在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實(shí)現(xiàn)。

     免疫組化染色和HE染色的不同之處可能HE染色比較粗略地辨認(rèn)不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;而后者能夠針對特異性細(xì)胞標(biāo)志物來檢測特異性細(xì)胞的改變(數(shù)量)、也可檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)位,組織中一些特異性蛋白的表達(dá)的量改變(通過圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析)。

?     通俗的講,HE僅僅是看大體病理改變,比如組織壞死,比如炎性滲出。免疫組化,看你的目的蛋白的表達(dá)情況

免疫組HE染色對比

     DABHE一樣也是一種染色劑,HE染色相對簡單,能分辨出細(xì)胞中的嗜酸嗜堿性物質(zhì);DAB染色全稱應(yīng)該叫做免疫化DAB染色,經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)后,DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。

常用的免疫組化染色方法

      組化用HRP的話,信號不夠強(qiáng)。通常用生物素標(biāo)記HRP來增強(qiáng)信號。

   ABC法(卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法)

?     ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性,與生物素化二抗結(jié)合,形成抗原+特異性抗體+生物素化二抗+卵白素+生物素+HRP復(fù)合物,后DAB顯色。

?     復(fù)合物配制:先將生物素與酶結(jié)合,形成生物素化HRP,以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合,形成卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。

   SP法(抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復(fù)合物)

?     本身沒有連接生物素,但有兩個生物素親和力*的結(jié)合位點(diǎn),可以與二抗上的生物素結(jié)合,敏感性高,復(fù)合物不需要使用前混合,更為簡便。

   PAP法

   直接法

樣本制備

 

 

 

免疫組化結(jié)果分析

    免疫組化結(jié)果的判斷原則:

?    必須設(shè)陽性對照和陰性對照。

?    抗原表達(dá)必須在特定部位。

?    陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。

免疫組化染色實(shí)驗組與對照組結(jié)果分析表 

    從表可以看出只有6、7實(shí)驗結(jié)果有意義。1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或IHC技術(shù)操作存在錯誤等而使實(shí)驗結(jié)果失去意義,必須重復(fù)實(shí)驗或換用Ab。

染色失敗的幾種情況及原因

  染色失敗的幾種情況。

?     所染的全部切片均為陰性結(jié)果,包括陽性對照在內(nèi)。

?     所有切片均呈陽性反應(yīng)。

?     所有切片背景過深。

?     陽性對照染色良好,檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。

所有切片呈陽性反應(yīng),其原因:

?     切片在染色過程中抗體過濃,或干片了。

?     緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準(zhǔn)確, 洗滌不*。

?     使用已變色的呈色底物溶液,或呈色反 應(yīng)時間過長。

?     抗體溫育的時間過長。

?     H2O2濃度過高,呈色速度過快且粘附劑太厚。

所有切片背景過深,其原因:

?     內(nèi)源性過氧化酶沒有*阻斷。

?     切片或涂片過厚。

?     漂洗不夠。

?     底物呈色反應(yīng)過久。

?     蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。

?     使用全血清抗體稀釋不夠。

陽性對照染色良好,檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)

?     常見的原因:

     標(biāo)本固定和處理不當(dāng)。

注意事項

?     蘇木素復(fù)染時間需要摸索,尤其要考慮陽性染色的位置。

?     切片脫蠟和水化要充分;加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分;每次加液前甩干洗滌液,但又防止干片。

?以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻:

     ①脫蠟不充分??梢?/span>60℃20min,立即放入新鮮的二甲苯中。

     ②水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇。

     ③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。抗體孵育時,切片放傾斜。

     ⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分。

     ⑥制片厚薄不均勻等問題。

     ⑦染片盒不平,切片傾斜。

?一抗的清洗:

     單獨(dú)沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。

     溫柔沖洗,防止切片的脫落,推薦用浸洗方式。

     沖洗的時間要足夠,才能*洗去 結(jié)合的物質(zhì)。

?PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用。

     建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。

     中性及弱鹼性條件(PH7-8)有利 于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強(qiáng)度則有利 于分解。

?拍照

     有條件的話應(yīng)該立即拍照,若不能及時拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度

 

 

 

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