相對定量原理

  在某些不需要對基因進(jìn)行絕付定量，只需要確定基因相對表達(dá)差異的情況下，如某基因在經(jīng)過某種處理后表達(dá)量是增加了還是減少了，用相對定量的方法就可以得到結(jié)果。相對定量是一種更普遍、更簡單的方法。機(jī)體的細(xì)胞中，一些基因的表達(dá)量是恒定的，這些基因可以被用作內(nèi)部參照（簡稱內(nèi)參）基因。相對定量就是通過檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)變化來實(shí)現(xiàn)定量的。正確選擇內(nèi)參可以平均起始樣本質(zhì)和量的誤差，以及反應(yīng)效率的誤差。內(nèi)參需滿足：①在研究中樣本之間的表達(dá)是相似的；②處理因素不會影響其表達(dá)；③與待測基因同時進(jìn)行相同的擴(kuò)增。在開始實(shí)驗(yàn)之前，須對所選擇的內(nèi)參進(jìn)行上述分析。

  一般推薦使用內(nèi)源性管家基因（housekeeping gene）作為內(nèi)參基因，管家基因的作用主 要有：①用于與目的基因拷貝數(shù)的比較；②作為內(nèi)對照補(bǔ)償待測樣本核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素；③參照物標(biāo)準(zhǔn)化。由 于管家基因在各種組織中是恒定表達(dá)的，所以可以用管家基因的量作為某種標(biāo)準(zhǔn)，以比較來源不同的樣本目的基因表達(dá)量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH、β2-tublin, β-actin、 efla、Cyclophilin和16SrRNA等。盡管在大多數(shù)情況下這些管家基因的表達(dá)非常穩(wěn)定，但是近有報(bào)道認(rèn)為這些管家基因的表達(dá)在某些情況下會發(fā)生變化。也就是說，并不是任何管家基因都適合任何試驗(yàn)。在選擇內(nèi)參基因時，應(yīng)仔細(xì)考慮各種因素，選擇合適的管家基因或管家基因組合。使用管家基因進(jìn)行相對定量不僅比定量更加簡單、經(jīng)濟(jì)，而且也更為可靠和準(zhǔn)確，但是管家基因畢競與目的基因存在較大的異源性，所以在反應(yīng)過程中會出現(xiàn)擴(kuò)增效率不一致的問題。下面將具體介紹各種相對定量的方法。

 （一）標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量

  此方法與定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法基本相似。不同之處是定量中只用構(gòu)建目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先已知的。而相對定量中需要同時構(gòu)建目的基因和內(nèi)參基因兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且相對定量中所用的標(biāo)準(zhǔn)品不用知道其準(zhǔn)確的拷貝數(shù)或濃度，只要知道其相對稀釋度即可。

  相對定量法中必須選定一個用于表達(dá)差異分析的參照體系，而且終得到的結(jié)果——未知樣品的量是相對于某個參照物的量而言的。該方法的步是制備標(biāo)準(zhǔn)品，包括目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品可以不知道準(zhǔn)確拷貝數(shù)或濃度，但必須準(zhǔn)確地進(jìn)行倍 比稀釋，一般為10倍的倍比稀釋。第二步就是分別將系列稀釋的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未知樣品和參照樣品中的目的基因和內(nèi)參基 因的表達(dá)量，并用內(nèi)參進(jìn)行均一化，即將目的基因的數(shù)量（微克、納克或拷貝數(shù)）除以與之相應(yīng)的內(nèi)參基因數(shù)量，可以看出，既定目的基因在參照體系中的表達(dá)量為1x，那么目的基因在其情況下的表達(dá)量以相對于參照體系的n倍表示，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)參照因子與目的基因擴(kuò)增效率不同時，可以用該方法進(jìn)行相對定量。

 （二）2-△△Ct法相對定量

  1、介紹

  2^-△△Ct法又稱為比較Ct法，其與標(biāo)準(zhǔn)曲線法類似，只不過其是用數(shù)學(xué)公式來取得同樣的相對定量結(jié)果，所不同的是其要求靶基因與參比內(nèi)標(biāo)具有相同的擴(kuò)增效率。在基因表達(dá)的研究中，一般我們只需要知道某個基因在不同時間或不同組織器官中表達(dá)水平的差異即可。所用的內(nèi)標(biāo)通常是一些隨時間及組織變化不大的管家基因如16srRNA、β-actin、GAPDH等。

  2^-△△Ct表示如果對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化使擴(kuò)增效率接近1，那么實(shí)驗(yàn)樣本經(jīng)過均一化處理后相對于參照樣本就是2^-△△Ct

相對倍數(shù)（實(shí)驗(yàn)組/參照組）=2^-△△Ct

   2、2^-△△Ct法計(jì)算

 在進(jìn)行2-△△Ct 相對定量時實(shí)驗(yàn)體系中必須包含實(shí)驗(yàn)組和參照組、目的基因和內(nèi)參基因。

          △Ct目的基因=Ct（目的基因）-Ct（同一樣本內(nèi)參基因）

          △△Ct目的基因=實(shí)驗(yàn)組△Ct目的基因-參照組△Ct目的基因

  參照樣本的選擇根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)類型確定的，其應(yīng)用有以下3中情況：

        （1）某種處理方法對基因表達(dá)的影響。

        （2）檢測基因在不同時間的表達(dá)差異。

        （3）比較基因在不同組織或樣本中的表達(dá)差異。